Clonación del cDNA, expresión y caracterización inicial del metabolismo

Disección de la eficacia de una técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc en 5′ (5′-RACE) para perfilar el repertorio de receptores de células T beta

La secuenciación profunda de los genes del receptor de células T (TCR) es muy eficaz para perfilar el repertorio inmunitario. Para preparar una biblioteca de secuenciación de TCR, se utiliza ampliamente la respuesta en cadena de la polimerasa multiplex (mPCR) y es extraordinariamente agradable de configurar.

 

  • Es decir, la mayoría de los productos de mPCR incorporan el reino muy importante para el reconocimiento del antígeno, lo que además significa una recombinación V(D)J frecuente. Sin embargo, la PCR multiplex puede sufrir el sesgo del cebador. Una alternativa prometedora es el 5′-RACE, que evita el sesgo de los cebadores al hacer uso de un solo par de cebadores. En la información de 5′-RACE, sin embargo, se ha visto recombinación V(D)J no regular (por ejemplo, secuencias TCR y nunca utilizando una parte del gen V) y la frecuencia varía (30-80%) entre los análisis.
  • Esto significa que la explicación o el aprendizaje de cómo reducir las secuencias TCR no regulares no es sin embargo bien conocido por el vecindario científico. Aunque es posible tomar un lugar de la puesta en marcha mediante la evaluación de los protocolos de 5′-RACE, cautelosa afirmación experimental es necesaria y tal mirada científica sigue siendo no obtenible.
  • Aquí mismo, examinamos el protocolo 5′-RACE de una herramienta industrial y demostramos cómo una modificación elevó la fracción de secuencias TCR-β regulares a >85%. Además, encontramos una sólida correlación lineal entre la fracción de fragmentos de ADN rápidos y la proporción de secuencias de TCR-β no regulares, lo que indica que la presencia de fragmentos de ADN rápidos dentro de la biblioteca era el primer propósito detrás de las secuencias de TCR-β no regulares.
  • En consecuencia, la eliminación exhaustiva de los fragmentos de ADN rápidos de una biblioteca 5′-RACE es el factor esencial para una eficacia informativa extrema. Abogamos extraordinariamente por la realización de un análisis de medición de fracciones antes de la secuenciación, y la fracción de fragmentos de ADN rápidos puede utilizarse para estimar la proporción de secuencias de TCR no regulares. Como la secuenciación profunda de los genes del TCR sigue siendo comparativamente cara, debería valer la pena una buena administración de la calidad.

 

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
Alpha Diagnostics
Frit Kit
Next Advance
Column Packing Kit
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piggenome

Descubrimiento de la evaluación: Gran familia de genes de la fosfoenolpiruvato carboxilasa dentro de la planta del metabolismo ácido crasuláceo Kalanchoepinnata (Crassulaceae) caracterizada por el análisis de la secuencia parcial del ADNc

 

Los clones que codifican una secuencia de ADNc de 1100 pb de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) de la planta constitutiva del metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM) Kalanchoepinnata (Lam.) Pers., han sido aislados mediante transcripción inversa-respuesta en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y caracterizados mediante análisis de polimorfismo de medición de fragmentos de restricción y secuenciación del ADN.

 

100 BP DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-100BP CORNING
1 KB DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-1KB CORNING
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.1 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.25 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-5 ApexBio

Se han recuperado siete isógenos distintos de PEPC, cuatro en las hojas y tres en las raíces (números de acceso del EMBL: AJ344052-AJ344058). Las comparaciones de similitud de secuencias y los cálculos de distancia de unión de vecinos separan las siete isoformas de PEPC en dos clados, uno de los cuales contiene las tres PEPCs actuales en las raíces. El segundo clado contiene las cuatro isoformas actuales en las hojas y se divide en dos ramas, una de las cuales contiene dos PEPCs más asociadas con las isoformas CAM descritas anteriormente.

 

De estas dos isoformas, sin embargo, sólo uno exhibió expresión apreciable en las hojas que realizan CAM, sin embargo no en las hojas muy jóvenes, que no exhiben CAM, lo que sugiere que esta isoforma codifica un PEPC específico de CAM. Los cálculos de la secuencia de la proteína aconsejan que todos los isógenos son aparentemente derivados de un gen ancestral normal, presumiblemente por eventos de duplicación genética en serie. Según nuestra información, esta es básicamente la identificación más completa de una familia de genes PEPC de una planta CAM, y el mejor número de isógenos PEPC reportados para cualquier planta vascular hasta este momento.

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Análisis molecular de un ADNc inducido por el estrés que codifica la preocupación de iniciación de la interpretación, eIF1, del pariente silvestre del arroz tolerante a la sal, Porteresiacoarctata

 

El análisis de la respuesta de las plantas al estrés es una vía importante para la invención de genes que confieren tolerancia al estrés. La síntesis de proteínas es muy delicada ante el estrés salino y las proteínas implicadas en este curso de es también un determinante muy importante de la tolerancia a la sal.

 

La planta halófila, PorteresiacoarctataTateoka, es un pariente en profundidad de Oryzasativa L., y tiene la capacidad de soportar cambios repentinos dentro de la salinidad del suelo. El cDNA de la preocupación de iniciación de la interpretación 1 (PceIF1) fue aislado de las hojas de P. coarctata que habían sido sometidas a un remedio de alta salinidad (150 mm de NaCl). Una mirada de expresión confirmó que la abundancia de los transcritos de eIF1 se elevó a un máximo diploma 5 d después de la inducción de estrés después de lo cual disminuyó a los rangos muy como las hojas de la administración (sin salar) los cultivos.

Protein A protein
Fitzgerald
Protein A Protein
Abbexa
pLDH Protein Protein
Abbexa

Este gen fue, además, regulado por el ácido abscísico exógeno (ABA) y las terapias de manitol, lo que sugiere que su inducción es expuesta a la impresión de déficit de agua de la sal extrema. Nuestro análisis confirmó que los rangos de expresión de los transcritos de eIF1 pueden ser un indicador útil para monitorear un mecanismo de respuesta al estrés que opera dentro de las hojas de P. coarctata.

Uridina difosfo-glucuronosiltransferasa 1A1, 2A1, 2B4, 2B31: clonación del ADNc, expresión y caracterización preliminar del metabolismo
Objetivo: Las uridina difosfo-glucuronosiltransferasas (UGT) son enzimas unidas a la membrana que catalizan la conjugación del ácido glucurónico en una serie de xenobióticos.

Los caballos glucuronidan de forma eficaz y extensa numerosos xenobióticos, junto con los opioides, lo que convierte a las UGT en un grupo esencial de enzimas metabolizadoras de fármacos para la eliminación de medicamentos. Las enzimas recombinantes han permitido a los investigadores caracterizar el metabolismo de muchos medicamentos. El primer objetivo era clonar, categorizar y caracterizar las UGT equinas utilizando medicamentos caracterizados como sustratos de UGT en diferentes especies. Un objetivo secundario era caracterizar el metabolismo in vitro de las vacunas en los caballos.

Diseño de la investigación: Investigación del metabolismo in vitro de los medicamentos utilizando microsomas hepáticos y programas de enzimas recombinantes.

Animales: Microsomas hepáticos y ARN de tejido recogido de dos yeguas de pura sangre a las que se les practicó la eutanasia por diferentes causas.

Estrategias: Basándose principalmente en la homología con el UGT2B7 humano, se expresaron 4 variantes de UGT equinas: UGT1A1, UGT2A1, UGT2B31 y UGT2B4. Se clonaron las secuencias de ADNc y se expresó la proteína resultante en un sistema de expresión de baculovirus. El rendimiento de las enzimas se evaluó utilizando 4-metilumbeliferona, testosterona, diclofenaco y ketoprofeno. A continuación, se incubaron la enzima recombinante, las células de gestión, los microsomas hepáticos equinos y los supersomas UGT2B7 humanos con la vacunación. Las concentraciones de metabolitos se midieron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem y se determinó la cinética de la enzima.

Paraffin Wax Dispenser
Scientific Laboratory Supplies
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
MagSi-WAX
AMSBIO
MagSi-WAX
AMSBIO

Resultados: La 4-metilumbeliferona fue glucuronizada por todas las UGTs equinas expresadas. El glucurónido de testosterona no fue producido por ninguna de las enzimas expresadas, y el glucurónido de diclofenaco y el glucurónido de ketoprofeno fueron producidos por UG2A1 y UGT1A1, respectivamente. El UGT2B31 metabolizó el glucurónido.

Conclusiones y relevancia científica: Esta es la primera expresión rentable de UGTs equinos recombinantes prácticos. El UGT2B31 contribuye a la glucuronidación; sin embargo, es muy probable que no sea la principal enzima metabolizadora. Estos resultados justifican una investigación adicional de las UGTs equinas, junto con la expresión de otras enzimas y la caracterización adicional de UGT2B31 como contribuyente al metabolismo.

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
Bioingentech
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MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
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Fuentes :

  1. Gentaur
  2. NCBI

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